О.Н. Ковалёва, Е.А. Спичак, А.С. Казакова
Азово-Черноморская агроинженерная академия, г. Зерноград, Россия
При прорастании семян в ходе активизации метаболических процессов генерируются активные формы кислорода (АФК), защита от которых осуществляется высокоактивной анти-оксидантной системой, состоящей из низко- и высокомолекулярных соединений [4]. Одними из важных компонентов этой системы являются аскорбиновая кислота (АК) и глутатион (GSH), составляющие единый аскорбат-глутатионовый цикл.
Исследования по содержанию низкомолекулярных антиоксидантов (НАО) в прорастающих семенах немногочисленны. Было показано, что содержание АК, GSH, а также активность катализирующих их окислительно-восстановительные превращения ферментов меняются в прорастающих семенах пшеницы [7], ячменя [6], риса [8]. Однако во всех этих исследованиях для анализа отбирали семена, набухавшие определенное время. Такой подход даёт усредненную характеристику изучаемого процесса, так как в анализ попадают семена, находящиеся на разных фазах прорастания. Полученные на основе такого подхода результаты не могут отражать протекание процесса в индивидуальном семени.
Нами было показано на отдельных сортах ячменя, что содержание АК и GSH изменяется по фазам прорастания семени ярового и озимого ячменя [1, 5]. Однако для создания общей характеристики окислительного обмена в семенах ячменя как культуры необходимо провести сравнительный анализ динамики содержания АК и GSH в прорастающем семени ярового и озимого ячменя. Для выполнения такой работы необходимо изучить набор сортов, семена которых были бы получены в один год и в одинаковых условиях. Кроме этого, для анализа следует отбирать семена, находящиеся в одной фазе прорастания. Это можно осуществить, применив в качестве морфологического критерия для отбора семян шкалу микрофенологических фаз прорастания семян (МФФ ПС) ячменя [2].
Целью работы явилось изучение содержания АК, GSH и значений общей редуцирующей активности (ОРА) по фазам прорастания индивидуального семени сортов ярового и озимого ячменя в условиях оптимального увлажнения.
Материалы и методы.
Объектом исследования служили семена сортов ярового (Рубикон, Виконт, Стимул, Мамлюк) и озимого (Зимур, Самсон, Романс) ячменя, внесённых в Госреестр селекционных достижений, допущенных к использованию по Северо-Кавказкому региону. Семена были выращены в учебно-опытном фермерском хозяйстве АЧГАА в 2007 году. Семена проращивали в рулонах при температуре +20оС на дистиллированной воде согласно ГОСТ-12038-84. Содержание аскорбиновой кислоты и глутатиона определяли в сухих семенах и по микрофенологическим фазам их прорастания - «точка» (наклевывание), «короткие корешки» (к-2), «длинные корешки» (к-3), «проросток» [2]. Содержание АК, GSH и значения ОРА определяли методом Петта в модификации Прокошева [3] и выражали в мкг/г на абсолютно сухую массу, которую определяли весовым методом. Анализ проводили на изолированных зародышах или ростках. Полученные результаты подвергали статистической обработке с использованием стандартных программ ПК.
Результаты и обсуждение.
В результате проведенного исследования были выявлены общие закономерности изменения количества АК, GSH и значений ОРА в тканях зародыша по фазам прорастания семян ярового и озимого ячменя в условиях оптимального увлажнения (рис.1). Так, от сухого семени к фазе «проросток» у ярового ячменя происходит увеличение содержания АК в 8 раз, у озимого - в 9 раз, а содержание GSH возрастает в 4 и 3 раза соответственно. Значения ОРА к фазе «проросток» от «сухого» увеличиваются в среднем в 5 раз, как у ярового, так и у озимого ячменя.
Ход изменения содержания АК в прорастающем семени озимого и ярового ячменя имеет общую закономерность, а отличия носят количественный характер (рис., а). Рост содержания АК у обоих видов ячменя происходит в ходе прорастания семени до фазы «к-3». Общее содержание АК у ярового ячменя и в сухом семени и по фазам его прорастания ниже, чем у озимого, однако содержание АК у ярового возрастает к фазе «к-3» в 8 раз, а у озимого -только в 5 раз. Можно предположить, что в семенах ярового ячменя в процессе прорастания накопление АК идёт более интенсивно. От фазы «к-3» к фазе «проросток» у озимого ячменя продолжается рост содержания АК (возрастает в 1,6 раза), а у ярового ячменя за этот период изменение содержания АК практически не наблюдается.
А вот содержание GSH у ярового ячменя увеличивается от сухого семени к фазе «к-3» в большей степени, чем у озимого (рис., б). За этот период содержание GSH у ярового ячменя увеличивается в 5 раз, а у озимого ячменя - в 3 раза. Но к фазе «проросток» у ярового ячменя наблюдается снижение содержания GSH, а у озимого продолжается дальнейший рост. Таким образом, ход кривых накопления АК и GSH в прорастающих семенах ярового и озимого ячменя меняется местами.
ОРА, которая характеризует суммарную работу этих двух антиоксидантов, от фазы «сухое семя» до фазы «к-3» имеет близкие значения, которые возрастают в семенах ярового ячменя в 5 раз, а у озимого - в 4 раза (рис., в). Затем к фазе «проросток» происходит снижение значений ОРА у ярового ячменя на 10%, а у озимого наблюдается к соответствующей фазе увеличение примерно на 30%.
Большой интерес для семеноводства и селекционной практики ячменя представляет сравнительный анализ содержания низкомолекулярных антиоксидантов в прорастающем семени различных сортов, поэтому нами были проанализированы семена лучших современных коммерческих сортов ярового и озимого ячменя и выявлены отличия между ними по содержанию АК, GSH и значений ОРА (таблица 1).
Для прорастающего семени большое значение имеет наличие и содержание антиокси-дантов или их предшественников в сухом семени. Проведённый анализ позволил выявить, что в сухих семенах ярового ячменя содержание АК и GSH ниже, чем в семенах озимого. Коэффициенты вариации содержания АК имеют близкие значения для сухих семян ярового и озимого ячменя, а для GSH отличие составляет 8%. Ещё одним отличием сухих семян является то, что у сортов ярового ячменя максимальное содержание АК соответствует минимальному содержанию GSH и наоборот (например, сорта Мамлюк и Виконт). У сортов озимого ячменя более высокое содержание АК в сухом семени всегда соответствует высокому содержанию GSH.
Фаза «точка», которая соответствует наклёвыванию семян, считается очень важным моментом в их прорастании, так как к этому времени активируются все метаболические процессы, образуется излишнее количество АФК, Таблица - Содержание ((мкг/г АСМ)*10-5) аскорбиновой кислоты, глутатиона и значения общей редуцирующей активности в тканях зародыша прорастающего семени четырёх сортов ярового ячменя по МФФ ПС в условиях оптимального увлажнения (*НАО - низкомолекулярные антиоксиданты). которые должны быть нейтрализованы, в первую очередь при участии компонентов аскорбат-глутатионового цикла.
В фазу «точка» абсолютное содержание АК в сухих семенах ярового и озимого ячменя имеет близкие значения (кривые на графике сближаются), но при этом возрастание содержания АК от фазы «сухое семя» в семенах ярового ячменя значительно выше (от 3,8 раза у сорта Мамлюк до 8,8 у сорта Виконт). В семенах озимого ячменя содержание АК за этот период возрастает только от 1,9 раза у сорта Зимур до 4,5 раза у сорта Самсон. Абсолютное содержание GSH в семенах ярового и озимого ячменя в фазу «точка» также имеет близкие значения, и при этом увеличение его количества за период от замачивания до наклёвывания семян одинаково и составляет от 1,5 (сорт Зимур) до 3,1 (сорт Мамлюк).
Фазы «к-2» (короткие корешки) и «к-3» (длинные корешки) позволяют разграничить во времени и охарактеризовать этапы формирования корневой системы проростка. В этот период происходят интенсивные синтетические процессы, которые требуют большого количества энергии, а это может быть сопряжено с интенсивным образованием АФК и напряжением окислительно-восстановительного статуса клетки. В эти две МФФ ПС между семенами ярового и озимого ячменя продолжают возрастать количественные различия по содержанию АК и GSH. При этом различие между сортами ярового ячменя по содержанию АК достигает минимума в фазу «к-3» (Квар = 2,9%), а у озимого - в фазу «к-2» (Квар=15%).
Содержание GSH у всех сортов ярового и озимого ячменя продолжает увеличиваться равномерно за весь период формирования зародышевой корневой системы. Максимальное содержание GSH наблюдается в фазу «к-3» у сорта озимого ячменя Самсон и сорта ярового ячменя Мамлюк.
К моменту формирования полноценного проростка по ГОСТу содержание АК и GSH изменяется по-разному. Содержание АК у двух сортов ярового ячменя (Виконт, Мамлюк) возрастает и у двух снижается (Стимул, Рубикон), а у сортов озимого ячменя происходит только его увеличение. Содержание GSH за этот период среди сортов ярового ячменя возрос только у Стимула, а у остальных снижается. Среди сортов озимого ячменя, наоборот, снижается только у Самсона, а у остальных возрастает.
Таблица - Содержание ((мкг/г АСМ)*10" ) аскорбиновой кислоты, глутатиона и значения общей редуцирующей активности в тканях зародыша прорастающего семени четырёх сортов ярового ячменя по МФФ ПС в условиях оптимального увлажнения ( НАО - низкомолекулярные антиоксиданты).
|
МФФ ПС |
НАО |
Сорта озимого ячменя |
Сорта ярового ячменя |
|||||||
|
Зимур |
Самсон |
Романс |
Квар, % |
Мамлюк |
Стимул |
Рубикон |
Виконт |
Квар, % |
||
|
|
||||||||||
|
сухое |
АК |
4,1±0,15 |
2,5±0,21 |
з,з±о |
24,2 |
2,4±0Д |
1,7±0Д |
1,5±0Д |
1,2±0,2 |
20,6 |
|
GSH |
47,6±0,53 |
24,1±3,07 |
34,2±1,47 |
33,4 |
22,4±2,5 |
25,5±1,8 |
38Д±2,8 |
36,0±0,8 |
25,3 |
|
|
ОРА |
201,6±0 |
106,8±7,63 |
148,9±4,8 |
31,2 |
100,2±9 |
102,8±7,3 |
140,9±7,5 |
139,6±4,5 |
18,5 |
|
|
точка |
АК |
7,7±0,7 |
11,3±0,4 |
8,2±0,5 |
21,5 |
9,2±0,9 |
8,8±0,8 |
6,7±0,6 |
10,5±0,6 |
18,0 |
|
GSH |
70,9±4,9 |
71±5,8 |
62Д±1,9 |
7,5 |
69Д±3,5 |
66,5±2,7 |
68,8±8,4 |
85,2±1,9 |
11,9 |
|
|
ОРА |
318,4±13,3 |
359,6±24 |
295,5±0 |
10,0 |
329,4±0 |
316,5±0 |
300Д±46,2 |
397,2±0 |
12,7 |
|
|
к-2 |
АК |
11,8±0,3 |
15,6±0,6 |
12,6±0,4 |
15,0 |
9,0±0,7 |
11Д±0,9 |
9,7±0,4 |
12,3±0,6 |
14,0 |
|
GSH |
91,8±13,3 |
98Д±5Д |
53,6±7,2 |
42,3 |
120,8±2Д |
81,7±1,7 |
86,5±2,6 |
104,2±3,2 |
18,3 |
|
|
ОРА |
432,7±46,4 |
497±16,6 |
271,5±19,4 |
29,0 |
299,3±5,6 |
392,5±7,8 |
401,5±12 |
432,6±7,3 |
15,0 |
|
|
к-3 |
АК |
16,8±1,8 |
23,4±1Д |
15±0,5 |
24,0 |
15,0±1,7 |
15,7±1,7 |
15,7±0,3 |
14,8±1,0 |
2,9 |
|
GSH |
106,3±2,9 |
152,8±16,2 |
83Д±Ю,2 |
31,1 |
202,0±13,2 |
108,6±5,4 |
125,9±4,5 |
165Д±19,5 |
27,7 |
|
|
ОРА |
537,3±24,4 |
763,9±58,8 |
441,2±27,6 |
28,5 |
629,7±71,7 |
525,8±36,5 |
587,9±45,9 |
706,3±55,8 |
18,9 |
|
|
Проросток |
АК |
35,2±4,2 |
26±1,6 |
29,8±0,7 |
15,2 |
17,5±2,7 |
14,7±0,7 |
13,7±0,3 |
15,0±1,9 |
9,5 |
|
GSH |
163,3±9,8 |
120,5±5,4 |
88,2±14,5 |
30,4 |
91,4±36,6 |
160,7±28,6 |
114Д±4,3 |
149,4±18,5 |
24,8 |
|
|
ОРА |
931,8±0 |
687,7±0 |
625,6±39Д |
21,6 |
314,7±31,9 |
690,9±51,6 |
527,2±35Д |
656,3±21,2 |
31,1 |
|
Значения ОРА, которая является результирующим показателем, у всех сортов ярового и озимого ячменя возрастают до фазы «к-3» и имеют близкие значения между сортами. За период формирования проростка значения ОРА возрастают только у сорта ярового ячменя Стимул, а снижаются только у сорта озимого ячменя Самсон.
Заключение.
Таким образом, в результате проведённого исследования впервые установлены закономерности изменения содержания АК и GSH по МФФ прорастания в условиях оптимального увлажнения семян ярового и озимого ячменя. Показано, что их содержание постепенно возрастает в процессе прорастания семян. Различия между семенами ярового и озимого ячменя носят количественный характер. Установлено, что по содержанию АК во все МФФ ПС сорта озимого ячменя превосходят сорта ярового, а по содержанию GSH наблюдается обратная картина. Показано, что по содержанию в сухих семенах НАО между сортами наблюдаются различия: коэффициент вариации по содержанию АК между сортами ярового ячменя составляет 20,6%, а озимого ячменя - 24,2%. Содержание GSH в сухих семенах варьирует ещё больше: коэффициент вариации составляет 25,3% и 33,4% для ярового и озимого ячменя соответственно. За первый период прорастания, до наклёвывания, содержание АК и GSH существенно возрастает у всех изученных сортов, причём сорта ярового ячменя характеризуются большим увеличением содержания НАО. Период формирования и роста корневой системы (МФФ ПС «к-2» и «к-3») характеризуется равномерным увеличением содержания НАО у всех изученных сортов ячменя. К моменту образования проростка у одних сортов ярового и озимого ячменя происходит увеличение содержания НАО, а у других снижение. Таким образом, выявленные закономерности изменения количества НАО по МФФ ПС ярового и озимого ячменя свидетельствуют о напряжённости окислительно-восстановительных процессов в тканях зародыша и их изменении при прорастании семян.
Литература
1. Ковалёва, О.Н., Казакова, А.С. Влияние водного стресса на ход изменения количества низкомолекулярных антиоксидантов в прорастающих семенах ярового ячменя //Мат. международной научно-практической конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», - г. Ростов-на-Дону, - Из-во СКНЦ ВШ ЮФУ- 2009.- с. 89
2. Казакова, А.С. Шкала микрофенологических фаз прорастания семян ярового ячменя. //А.С. Казакова, С.Ю. Козяева / Сельскохозяйственная биология. - 2009.- № 3. - с. 88-92
3. Практикум по физиологии растений. Под ред. Третьякова Н.Н. М.; Из-во «Колосс». 2003. - с.288
4. Полесская, О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода: учебное пособие /О.Г. Полесская; Под ред. И.П. Ермакова. - Москва: КДУ, 2007. - 140 с.
5. Спичак, Е.А., Казакова, А.С. Сортовые различия содержания низкомолекулярных антиокси-дантов в прорастающих семенах озимого ячменя // Е.А Спичак., А.С. Казакова. Материалы 5 общерос. науч.-практ. конф. Актуальные вопросы современной науки и образования. Красноярск. 2010г., с.226
6. Bonsager B.C. Proteomic and activity profiles of ascorbat-glutathione enzymes in germinating barley embryo // Bonsager B.C., Shaphiri A., Finnie C., Svensson B. / Phytochemistry, 2010. V. 71, №14-15, p. 1650-1656.
7. Esfandiari E. The effect of water stress on antioxidant content, protective enzyme activity, proline content and lipid peroxidation in wheat seedlings // Esfandiari E., V. R. Shakiba, S.A. Mahloob, S. Shahabivand. / Pakistan J. Biol. Sci. 2008. V. 11, № 15, p. 1916-1922.
8. Kaveri Das K. Antioxidant enzymes and aldehyde releasing capacity of rice cultivars (Oriza sativa L.) as determinants of anaerobic seedling establishment capacity. // Kaveri Das K., Panda D., Nagaraju M., Sharma S.G., Sarkar R.K. / Bulg. J. Plant Physiol. 2004. V. 30, №1-2, p. 34-44.
Источник - ВЕСТНИК МичГАУ, № 1, Печатная версия