Н.В. Соловых, С.А. Муратова ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина», г. Мичуринск, Россия
Введение
Вопрос регуляции морфогенеза из соматических тканей растений является одним из важнейших как для изучения фундаментальных проблем биологии, так и для решения ряда практических задач, связанных с применением клеточных и тканевых технологий. Методы регенерации из изолированных тканей являются основой биотехнологических приемов, направленных на расширение генетического разнообразия сельскохозяйственных культур.
Растительные клетки принято считать тотипотентными, т.е. способными при надлежащих условиях сформировать целое растение (Бутенко, 1964; 1999). Но на практике даже в максимально оптимизированной системе на путь регенерации становятся лишь единичные клетки. Существует большое количество работ, посвященных рассмотрению трудностей морфогенеза, причин перехода неорганизованно растущих клеток к формированию дифференцированных структур, определены некоторые общие закономерности регенерации растений из соматических и генеративных тканей. Однако не существует универсальных методов индукции данного процесса. Для многих плодово-ягодных растений морфогенез в культуре тканей остается открытым вопросом, что обусловлено видо- и сортоспецифичностью этих растений, требующих индивидуальной оптимизации условий культивирования.
Эффективность морфогенеза из соматических тканей определяется генотипом растения, типом и местом взятия исходного экспланта, ориентацией его на питательной среде, минеральным и гормональным составом сред, составом и количеством сахаров в питательных средах, температурой и световым режимом культивирования эксплантов и другими факторами.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в индукции морфогенеза из изолированных тканей представителей рода Rubus, следует отметить, что методика регенерации разработана в основном для малины красной (Couseneau, Donnelly, 1991; Высоцкий, Хамукова, 1993; Расторгуев, 1996; 2006). Отсутствуют данные по регенерации растений из соматических тканей малины чёрной, культуры, приобретающей всё большую популярность. Лишь отдельные работы (Соловых и др., 2004; Соловых, 2009) посвящены вопросам морфогенеза in vitro из изолированных тканей ежевики и малино-ежевичных гибридов. Недостаточно изучено влияние на процесс адвентивного морфогенеза растений рода Rubus общего количества азота, а также соотношения аммонийного и нитратного азота в питательной среде. Существуют разногласия в вопросе об оптимальном соотношении ауксинов и цитокининов в среде для регенерации. Из веществ с цитокининовой активностью подавляющим большинством исследователей использовались только 6-бензиламинопурин (6-БАП) и кинетин.
Целью проведённых исследований являлась оптимизация методов индукции морфогенеза из изолированных соматических тканей представителей рода Rubus на основе изучения влияния типа экспланта, минерального и гормонального состава сред и светового режима на процесс регенерации адвентивных побегов.
Материалы и методы
В работе использованы сорта малины красной Вольница и Спутница, малино-ежевичные гибриды Бойзенберри и Логанберри, ежевика сорта Блэк сэтин и малина чёрная сорта Кумберленд.
При разработке эффективных методов индукции морфогенеза из соматических тканей представителей рода Rubus изучали влияние на процесс регенерации растений типа первичного экспланта, его ориентации на поверхности агаризованной среды, минерального и гормонального состава сред и режима освещения.
В качестве первичных эксплантов использованы фрагменты корней, стеблей и листьев растений, культивируемых in vitro. Культивирование эксплантов in vitro проводили по общепринятым методикам (Бутенко, 1999) в нашей модификации (Соловых, 2009) на средах с минеральным составом по прописям MS (Murashige, Skoog, 1962), QL (Quoirin Lepoivre, 1977), модифицированную Стандарди (Standardi, Catalano, 1984) и Андерсона (по Расторгуеву, 1996, с. 44). Использовали также среду MS в нашей модификации, заменив хлорид кальция нитратом в той же молярной концентрации, сахарозу глюкозой и вдвое увеличив содержание хелата железа.
Для изучения действия на процесс морфогенеза фитогормонов использовали вещества из группы ауксинов: 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), индолилуксусную кислоту (ИУК), ?-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ?-нафтилуксусную кислоту (НУК) и вещества с цитокининовой активностью 6-фурфуриламинопурин (кинетин), 6-бензиламинопурин (6-БАП), 2-изопентиладенин (2-iP), зеатин, N-фенил-N-1,2,3-тидиазолил-5-мочевину или тидиазурон (ТДЗ). Экзогенные регуляторы роста вносили в среды для регенерации в концентрациях от 0,5 до 5,0 мг/л.
Действие различных антиоксидантов на частоту адвентивного морфогенеза из листовых эксплантов изучали, добавляя в среды для регенерации аскорбиновую кислоту, глутатион восстановленный и рутин в концентрациях 100, 250, 500, 750 и 1000 м кКМу.л ьтивирование эксплантов в течение 2 – 3 недель после высадки на среды для регенерации проводили в темноте, при рассеянном освещении (100 – 150 люкс) или при интенсивном освещении (2000 – 3000 люкс). В дальнейшем все культуральные сосуды помещали в условия интенсивного освещения.
Учитывали число адвентивных побегов, образовавшихся на каждом из первичных эксплантов (прямая регенерация), число эксплантов, образовавших каллус, число каллусов, образовавших адвентивные побеги, и число побегов на каждый эксплант. Математическая обработка результатов исследований проведена с помощью пакета анализа программы Microsoft Office Excel (2003).
Результаты исследований и обсуждение
Существенное влияние на частоту морфогенеза оказывает генотип растений. Высоким морфогенетическим потенциалом обладает ежевика и малино-ежевичный гибрид Бойзенберри. В оптимальных вариантах частота морфогенеза у этих форм достигает 31,67% и 28,33% соответственно. У малины красной сорта Вольница этот показатель не превышает 20,00%, а у малины чёрной сорта Кумберленд даже в оптимальных вариантах составляет 10,00 -18,33%, при среднем числе побегов на эксплант от 0,58 до 0,90 штук. Крайне низким морфогенетическим потенциалом характеризуется малина красная сорта Спутница. Из её листовых эксплантов получены лишь единичные регенеранты на среде QL, содержащей 3,0 мг/л 2iP и 0,5 мг/л ИМК, и среде Андерсона, содержащей 2,0 мг/л зеатина и 0,5 мг/л ИУК.
Оценивали морфогенетический потенциал различных вегетативных органов растения – листьев, стебля, корней. По нашим данным, листовые ткани растений рода Rubus обладают более высоким морфогенетическим потенциалом по сравнению с тканями стебля и корня. Так, у ежевики сорта Блэк сэтин на среде MS, содержащей 2 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ИУК, частота регенерации адвентивных побегов из корневых эксплантов составила 0,55%, из стеблевых 11,67%, а из листовых 23,33%. На аналогичной среде подобные результаты получены и для малино-ежевичного гибрида Бойзенберри. Частота морфогенеза из листовых эксплантов у этой формы составила 26,67%, из стеблевых 13,33%. Из фрагментов корня регенерантов получить не удалось.
Длительное культивирование каллусов листового, корневого или стеблевого происхождения in vitro, снижая частоту регенерации, уменьшает различия в их морфогенетическом потенциале. Уже в четвёртом пассаже (через 6 -7 месяцев) у каллусных культур различного происхождения не удаётся обнаружить существенной разницы по частоте регенерации адвентивных побегов и их среднему числу на один эксплант.
Для индукции морфогенеза более эффективным является помещение листовых эксплантов адаксиальной стороной к поверхности питательной среды. При этом по сравнению с ориентацией абаксиальной стороной к поверхности среды на 18,33% (Блэк сэтин) – 34,33% (Бойзенберри) возрастает процент эксплантов, образующих каллус. Существенно возрастает также частота регенерации (рис. 1).
В процессе изучения влияния минерального состава сред на частоту адвентивного морфогенеза представителей рода Rubus установлено, что среда MS позволяет получать адвентивные побеги у всех изученных генотипов. Для малины красной (Вольница), малины чёрной и ежевики Блэк сэтин частота регенерации увеличивалась при замене среды MS на среды более бедные азотом - QL или Андерсона.
Большое значение для морфогенеза имеют азотсодержащие минеральные соли. Считается, что для начала морфогенеза важно содержание в питательной среде иона NH4 + , а для развития образовавшихся морфогенных структур важен ион NO3- , то есть необходимо регулировать соотношение аммонийного и нитратного азота (Бутенко, 1999).
Экспланты высаживали на питательную среду по прописям Андерсона или QL, через 14 дней их переносили на модифицированную среду MS, в которой хлорид кальция заменён нитратом с сохранением молярных концентраций солей кальция и увеличено вдвое содержание хелата железа. Это позволило при сохранении практически той же частоты морфогенеза увеличить число побегов-регенерантов на один эксплант для большинства изучаемых генотипов (рис. 2,3).
Рис. 3 (рисунки см. в печатной версии) – Влияние минерального состава питательных сред на среднее число адвентивных побегов на один эксплант у растений рода Rubus (1 – среда MS; 2 – среда Андерсона; 3 – среда Андерсона, пересадка через 10 дней на модифицированную среду MS).
Успех индукции морфогенеза определяется, главным образом, соотношением цитокининов и ауксинов в питательной среде. Принято считать, что количество добавляемых в среду экзогенных регуляторов роста должно находиться в связи с балансом эндогенных фитогормонов (Расторгуев, 1996). Поэтому оптимальное содержание в среде физиологически активных веществ зависит от вида и даже от сорта растениРяе. зультаты проведённых исследований позволяют утверждать, что для индукции морфогенеза из листовых эксплантов растений рода Rubus достаточно универсальной является среда, содержащая 2,0 – 5,0 мг/л цитокинина и один из ауксинов в концентрации 0,5 – 1,0 мг/л.
Максимальный процент эксплантов, образовавших адвентивные побеги, и наибольшее число побегов на один эксплант достигается при использовании в качестве вещества с цитокининовой активностью 6-БАП, наибольшая их длина – при использовании зеатина. Добавление кинетина и 2iP оказалось менее эффективным, чем применение 6-БАП. Внесение вместо 6-БАП в среду для регенерации зеатина приводило к повышению частоты адвентивного морфогенеза у ежевики на 13,33% -23,67%, но к снижению её у других изучаемых генотипов. Применение ТДЗ в качестве вещества с цитокининовой активностью в отдельных вариантах позволило повысить частоту морфогенеза у малино-ежевичного гибрида Логанберри и ежевики Блэк сэтин на 35,00% и 21,50% соответственно. Однако эффективность ТДЗ не подтверждалась регулярНноа ивб орлаезне ыэ хф офпеыктаихв.н ыми веществами из группы ауксинов оказались ИМК и ИУК. Причём при использовании ИУК регенерация в подавляющем большинстве случаев идёт по типу непрямого органогенеза, т.е. путем формирования адвентивных побегов на предварительно индуцированном из экспланта каллусе (рис. 4). Использование ИМК в ряде случаев вызывало образование придаточных побегов непосредственно из листового экспланта, т.е. прямой органогенез (рис.5). Использование 2,4-Д и НУК позволило получить единичные регенеранты лишь у малино-ежевичного гибрида Логанберри.
Оптимальные соотношения концентрации цитокининов и концентрации ауксинов варьируют для разных генотипов от 4:1 до 6:1, т.е. 2,0 – 3,0 мг/л цитокинина и 0,5 мг/л ауксина. Увеличение концентрации цитокинина до 4,0 – 5,0 мг/л даёт слабое увеличение частоты морфогенеза, но существенно повышает число адвентивных побегов на один эксплант (рис.6).
Рис. 4 – Непрямая регенерация из листовых эксплантов ежевики сорта Блэк сэтин на питательной среде MS, содержащей 2,0 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ИУК.
Рис. 5 – Прямая регенерация из листовых эксплантов ежевики сорта Блэк сэтин на питательной среде MS, содержащей 2,0 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ИМК.
Однако с ростом концентрации цитокинина увеличивается и процент витрифицированных побегов. На средах, содержащих 5,0 мг/л 6-БАП, он достигает 45,33% у Бойзенберри, и 69,06% у ежевики сорта Блэк сэтин. Поэтому следует считать нецелесообразным повышение концентрации цитокининов свыше 2,0 – 3,0 мг/л в средах для индукции морфогенеза из изолированных тканей ежевики и малино-ежевичных гибридов.
Рис. 6 – Влияние концентрации 6-БАП в питательной среде на частоту регенерации и среднее число побегов на один эксплант у ежевики сорта Блэк сэтин (среда MS, 0,5 мг/л ИУК, 0,5 мг/л ГК; 45 суток культивирования).
Для всех изученных генотипов отмечено положительное влияние добавления в среду 1,0 мг/л ГК, которая позволяет получить большее количество достаточно крупных адвентивных побегов, пригодных для укоренения, а в ряде случаев уменьшить витрификацию.
Установлено, что добавление в питательные среды антиоксидантов увеличивает количество образовавшихся адвентивных побегов. Наиболее эффективным оказалось применение глутатиона восстановленного в концентрациях 250 – 500 мкМ или аскорбиновой кислоты в концентрациях 500 – 750 мкМ. Их использование позволило увеличить частоту морфогенеза у изучаемых видов в 1,2 – 1,4 раза. Менее эффективным оказался рутин.
Морфогенез из листовых эксплантов растений рода Rubus наблюдался при всех изучаемых режимах освещения. Однако частота адвентивного морфогенеза возрастала на 17,0% (ежевика сорта Блэк сэтин) – 32,7% (малино-ежевичный гибрид Бойзенберри), если культуральные сосуды в течение 2 - 3 недель после высадки эксплантов на среду для регенерации содержали в темноте или в условиях рассеянного освещения, а затем помещали их в условия интенсивного освещения.
С использованием разработанных методов индукции морфогенеза осуществлена регенерация адвентивных побегов из отобранных в процессе тканевой селекции на солеустойчивость каллусных культур малино-ежевичного гибрида Бойзенберри и малины красной сорта Беглянка. Это позволило продолжить работу по получению солеустойчивых форм, которую ограничивали трудности регенерации из длительно культивируемых in vitro каллусов. Полученные побеги прошли размножение и укоренение in vitro, а затем адаптацию к условиям in vivo в теплицах с воздушно-капельным орошением.
Выводы
Высокую частоту морфогенеза из изолированных органов и тканей малины красной, малины черной, ежевики и малино-ежевичных гибридов удаётся получить на средах MS, QL и Андерсона, содержащих 1,0 – 3,0 мг/л 6-БАП и 0,5 – 1,0 мг/л ИУК. Увеличение содержания цитокинина до 4,0 мг/л и выше приводит к витрификации побеговД. ля образования первичных морфогенных структур на начальном этапе культивирования более пригодны среды с низким содержанием азота. Перенос через две недели культивирования эксплантов на среды с повышенным содержанием NO3-, приводит к увеличению числа развившихся адвентивных побегов.
Добавление в питательные среды антиоксидантов позволяет существенно увеличить частоту адвентивного морфогенеза у малины красной, малины черной, ежевики и малино-ежевичных гибридов. Наиболее эффективным является внесение в среды 500 - 750 мкМ аскорбиновой кислоты или 250 - 500 мкМ глутатиона восстанЧовалстеонтнао агод.в ентивного морфогенеза возрастает при культивировании изолированных тканей растений рода Rubus в темноте или в условиях рассеянного освещения в течение первых двух недель после помещения на среды для регенерации.
Литература
1.Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений.-М.:Наука, 1964. – 272с.
2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: Учебное пособие. - М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. -160 с.
3. Высоцкий В.А., Хамукова Ф.М. Возможности регенерации растений земляники и малины из каллусов различного происхождения// Ягодоводство в Нечерноземье/ Сб. научных трудов ВСТИСП, М. – 1993. – С. 19-24.
4. Расторгуев С.Л. Регенерация растений из изолированных соматических тканей земляники и малины// Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур: Методические рекомендации. - Мичуринск, 1996.-С. 40-61.
5. Расторгуев С.Л. Индукция морфогенеза в культуре каллусной ткани малины// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук, М., 2006, -№6, -С. 41 – 43.
6. Соловых Н.В., Тюленев В.М., Муратова С.А. Совершенствование методик регенерации адвентивных побегов из соматических тканей представителей рода Rubus// Ягодоводство на современном этапе: Материалы междунар. научно-практической конференции, посвящённой 100-летию со дня рождения А.Г. Волузнева. -пос. Самохваловичи 13-15 июля 2004 года. – Самохваловичи, -2004. –Т.15, -С. 217-219.
7. Соловых Н.В. Использование биотехнологических методов в работе с ягодными культурами: Метод. рекомендации. ГНУ ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина. – Мичуринск – наукоград РФ, Изд. Мичуринского гос. аграрного университета, 2009. – 47 с.
8. Couseneau J.C., Donnelly D.S. Adventitious shoot regeneration from leaf explants of tissue cultured and greenhouse-grown raspberry//Plant Cell Tiss. And Organ Cult. -1991. -V.27, №3. –P. 249-255.
9. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures// Physiol. Plant. - 1962. - V.15, - №13. - Р. 473-497.
10. Quoirin M., Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp.//Acta Hortic.-1977. –V.78. –P. 437-442.
11. Standardi A., Catalano F. Tissue culture propagation of kiwifruit // Comb. proc. Intern. plant propagators’ soc. – 1984. – Vol.34. – P. 236-243.
Источник - ВЕСТНИК МИЧУРИНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО АГРАРНОГО УНИВЕРСИТЕТА, научно-производственный журнал, 2010, № 2, Печатная версия.