А.Ю. Скрипников

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, г. Москва, Россия

Д.Д. Шефер, Ж.-П. Зрид

Лозаннский университет, Лозанна СН-1015, Швейцария

Введение

Векторные процессы, лежащие в основе детерминации плоскости деления растительных клеток, тесно связаны с морфогенезом растений. Развитие растений можно рассматривать как последовательность клеточных делений, протекание которых отличается согласованностью и геометрической упорядоченностью. В результате делений, во-первых, образуется форма дочерних клеток. Это происходит за счет того, что клеточная стенка, разделяющая дочерние клетки, откладывается в определенной плоскости. Затем она приобретает жёсткость. В результате форма клеток не меняется [1]. Во-вторых, ориентировка делений детерминирует упорядоченную организацию клеточных стенок в масштабе многоклеточной ткани [2]. Группы клеток, прочно «сцементированные» друг с другом клеточными стенками, в соответствии с определенными геометрическими закономерностями образуют сложные композиции, паттерны [3].

Одним из первых на механические свойства «скелетных» тканей растений, основу которых составляют целлюлозные компоненты клеточных стенок, обратил внимание известный отечественный биолог В.Ф. Раздорский. Он показал ведущую роль механических свойств растительных тканей в формировании архитектоники высших растений [4]. В середине прошлого века, работая в Плодоовощном институте им. И.В. Мичурина, на основе инженерного опыта исследования анатомии растений в своих фундаментальных трудах В.Ф. Раздорский изложил основные концепции биомеханики как новой науки [5]. В тот же период работы в Мичуринске В.Ф. Раздорский одним из первых подчеркнул значение открытия фрагмосомы [5, 6], которое в настоящее время привело к формированию концепции цитокинетического аппарата — системы ориентированного отложения клеточной пластинки в процессе деления клеток [1, 7]. Таким образом, современные представления о клеточных механизмах и движущих силах роста и формообразования растений сложились в значительной степени благодаря изучению компонентов клеточных стенок, цитоскелета и цитокинетического аппарата [7-9]. Вместе с тем взаимосвязь между ориентацией плоскости деления отдельных клеток и морфогенезом целых растений во многом не ясна и остается важнейшей проблемой биологии растений. Ее решение осложняется и сдерживается трудностями при создании модельных систем в «размытой», без четких границ области экспериментального морфогенеза, которая начинается одной клеткой и заканчивается целым организмом [10, 11].

В связи с разработкой новых модельных систем для исследования молекулярных механизмов развития растений представляют интерес культуры водорослей, мхов и папоротников [10]. Перспективность мхов в экспериментальном морфогенезе связана с четко выраженными реакциями их клеток в ответ на векторное воздействие электромагнитных и гравитационных стимулов [12]. Кроме того, мхи обладают уникальной особенностью интегрировать генно-инженерные конструкции в геном по пути гомологичной рекомбинации [13]. Во многом благодаря этому мох Physcomitrella patens недавно был выбран в качестве значительного объекта для полной расшифровки ядерного генома [14]. Последнее событие значительно расширило возможности растительной протеомики и пептидомики [15], которые были использованы применительно к протопластам P. patens. В результате было установлено, что выделение протопластов сопровождается изменением протеомного профиля и фрагментацей белков [16], а также образованием значительного количества небольших (до 2,5 кДа) эндогенных пептидов [17]. Изменение белкового состава и генерация пептидного пула демонстрируют то, что образование протопластов мха является процессом, существенно изменяющим морфофизиологический статус клетки, связанный с переходом в меристемное состояние. Таким образом, недавние исследования протео-мики и пептидомики P. patens существенно расширили и дополнили представления о протопластах мха как об одноклеточной системе для изучения молекулярных основ процессов развития.

В представленном исследовании протопласты P. patens использованы в качестве одноклеточной системы при изучении биофизических механизмов ориентации цитокине-тического аппарата растительной клетки, которые в настоящее время остаются нерас-крытыми. В качестве внешнего векторного фактора впервые использован плоско-поляризованный свет. Установлено, что дихроичные пигментные системы вовлечены в процессы трансдукции векторного электромагнитного сигнала на веретено деления и фрагмопласт во время первого деления протопластов мха P. patens. Проведенные исследования расширяют современные представления о природе фотополяротропизма, в генерации которого впервые показана роль цитокинетического аппарата. Разработанная модель может служить основой для протеомного анализа цитокинеза растительной клетки и исследования роли пептидов в физиологической регуляции клеточной активности.

Материалы и методы исследования

Выращивание протонемы мха, получение протопластов и инкубация протопластов. Протонему мха Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. выращивали на модифицированной агаризованной среде Кнопа [18] (среда PPNO3) при освещении белым светом от люминесцентных ламп (F96T12/GRO/VHO/WS – Sylvania, USA) с фотонным потоком 61мкМ/м2•с в условиях 16 ч фотопериода при 26 °С. Для выделения протопластов из протонемы использовали 1% раствор фермента Driselase (Fluka) в 0,48 М растворе ман-нитола (Fluka) [19]. Чашки Петри с протопластами, заключёнными в агаризованную среду, устанавливали в горизонтальном положении и проводили инкубацию на белом поляризованном или неполяризованном свету, падающим вертикально от люминесцентных ламп Sylvania, расположенных над ними, с квантовым потоком 16 мкМ/м2•с при 16 ч фотопериоде и 26 °С. Для изучения поляротропизма чашки Петри накрывали полимерными поляризационными фильтрами. В контрольном опыте протопласты инкубировали на «естественном» (неполяризованном) белом свету, квантовый поток которого регулировали с помощью стальной сетки.

Иммунофлуоресцентная микроскопия. Протопласты мха, регенерация которых проводилась в толще агаризованной среды, фиксировали через 1, 12, 24, 54, 66, и 96 ч после выделения. Фиксацию протопластов проводили в 4% растворе Paraformaldehyde (Fluka, Швейцария) в течение 1 ч при 20 °С. После трехкратной промывки препарата буферным раствором протопласты в агаровом слое обрабатывались 0,5% раствором Driselase (Fluka). После этого протопласты промывали буферным «блокирующим» раствором с добавлением бычьего сывороточного альбумина и обрабатывались антителами к альфа-тубулину (Amersham Rahn, Великобритания). Затем после промывки препарат обрабатывали «вторичными» антителами к иммуноглобулинам, конъюгированными с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) (Amersham Rahn). После отмывки из препаратов антител протопласты обрабатывали 1 мкг/мл раствором Hoechst 33258 (Sigma, США). Препараты изучали под микроскопом Leitz Diaplan (Германия), оборудованным специальной охлаждаемой CCD видеокамерой AT200 (Photometrics, США). Изображения снимались и обрабатывались с использованием программы Photometrics Image Processing Software (Photometrics, США). С помощью этой же программы измеряли угол между эк-ваториальной плоскостью веретена или фрагмопласта и откладывали на гистограмме с интервалом в 10°. В каждом эксперименте анализировали ориентацию не менее 300 ми-тотических веретен и фрагмопластов.

Результаты

В процессе выделения протопластов из протонемы весьма быстро, в течение секунд, протопласт отделяется от внутренней поверхности клеточной стенки и выходит в гипертонический раствор через небольшое (5-10 мкм) отверстие в клеточной стенке обычно в апикальной области, меняет форму и превращается в сферическое образование диаметром 25 мкм. В распределении хлоропластов, ядер, микротрубочек не выявляется признаков асимметрии и поляризации. На основании этих признаков протопласты можно считать аполярными сферическими образованиями. Ядра, как правило, занимают несколько смещённое от центра положение. Пучки микротрубочек равномерно распределены в цитоплазме. Микротрубочки могут располагаться вблизи поверхности ядра. В цитоплазме пучки микротрубочек образуют сетчатую конфигурацию, за счёт того, что они огибают многочисленные хлоропласты размером 5-6 мкм, иногда проходя в плотном контакте с ними. Пучки микротрубочек, как правило, обнаруживаются в кортикальном слое. В цитоплазме выделяются пучки микротрубочек, идущие из перинуклеарной области к цитоплазматической периферии.

В протопластах, регенерация которых проходит на поляризованном свету, микротрубочки не образуют структур, которые могли бы считаться ориентированными определённым образом по отношению к электрическому вектору. На неполяризованном свету, в контрольной культуре протопластов, пучки микротрубочек также не обнаруживают предпочтительной ориентации по отношению к какой-либо оси. Можно полагать, что на данном этапе развития с момента выделения, протопласты продолжают оставаться мор-фофизиологически аполярными структурами. Установлено, что в темноте протопласты P. patens не делятся.



Рисунок 1 – Метафазное веретено в протопластах, регенерация которых проходит на поляризованном свету. Цитоплазматические микротрубочки элиминируются, центр клетки занят митотическим веретеном с темной экваториальной зоной (А), которой соответствует «ассамблея» хромосом, выстроенных в метафазной пластинке (Б).

Двойная стрелка показывает направление колебаний электрического вектора.

Масштабная линейка 10 мкм.

Первые делящиеся протопласты обнаруживаются через 30 ч после их инкубации как на естественном, так и на поляризованном свету в условиях 16 ч фотопериода. Наибольшее число митотических веретён («волну митозов») в культуре протопластов можно наблюдать через 54 ч после начала инкубации протопластов. Чашки Петри с протопластами помещали в инкубационный бокс в 21 ч, немедленно после энзиматического выделения и заливки в агаризованный слой на поверхности целлофанового диска. Свет отключался на 8 часов в 22 ч. Именно в таких фотопериодических условиях с 2 ч ночи до 4 ч утра в протонематических клетках P. patens наблюдалось наибольшее число митозов [20]. Во время перехода от интерфазы к митозу в протопластах P. patens не обнаруживаются препрофазные кольцевые пучки микротрубочек. Митотическое веретено, как правило, занимает центральную область сферического протопласта. Метафазная пластинка находится на равных расстояниях от полюсов веретена и ориентирована перпендикулярно по отношению к оси веретена. Метафазное веретено в протопластах, как правило, имеет широкие полюса. Пучки микротрубочек, образующие веретено деления, образуют подгруппы, сходящиеся на «мини-полюсах» (рис. 1). Во время митоза веретено деления, как правило, занимает центральную область протопласта, который сохраняет сферическую форму.

Во время телофазы вокруг дочерних ядер формируются новые мембраны. В этот момент фрагмопласт располагается между двумя дочерними ядрами. Экватор фрагмо-пласта расположен под прямым углом к оси веретена. Микротрубочки идут от экваториальной зоны веретена и «опираются» на проксимальные поверхности молодых дочерних ядер. От других (дистальных и латеральных) поверхностей ядер немногочисленные микротрубочки радиально отходят во всех направлениях. Телофазное веретено в большинстве случаев располагается в центре сферического протопласта.

Ранний фрагмопласт обладает веретеновидной (бочковидной) формой. Экваториальная плоскость фрагмопласта наследует ориентацию метафазной пластинки, равноудалена от дочерних ядер и перпендикулярна оси, соединяющей их. Во время цитокинеза фрагмопласт растёт центробежно к клеточной периферии. Поздний фрагмопласт в некоторых протопластах делит цитоплазму практически сферической клетки на две половины.

Важным морфофизиологическим различием между контрольной и опытной культурой протопластов является ориентация веретена деления, фрагмопласта и плоскости клеточной стенки между дочерними клетками.
Метафазная пластинка ориентирована перпендикулярно по отношению к элек-трическому вектору поляризованного света. В протопластах, делящихся на неполяризо-ванном свету, веретёна ориентированы случайным образом во всех направлениях. Принимая во внимание то, что экваториальная плоскость веретена в делящемся протопласте мха перпендикулярна его оси (рис. 1), можно заключить, что ось веретена параллельна электрическому вектору поляризованного света.

Экваториальная плоскость фрагмопласта (рис. 2) перпендикулярна электрическому вектору, когда протопласты регенерируют на поляризованном свету. В контрольной культуре протопластов на неполяризованном свету фрагмопласты ориентированы беспорядочно во всех направлениях. Ось, соединяющая дочерние ядра, разделённые ранним фрагмопластом, логически должна быть параллельна электрическому вектору поляризованного света, поскольку комплекс раннего фрагмопласта с дочерними ядрами, как и веретено, образует симметричную конфигурацию, а прямая, соединяющая ядра, перпендикулярна экватору фрагмопласта в начале цитокинеза.

Обсуждение результатов

Регенерация протопластов мхов во многом сходна с прорастанием спор [21] и существенно отличается от регенерации протопластов семенных растений. Из-за отсутствия типичной для регенерации протопластов семенных растений «каллусной фазы», развитие протопластов мхов считают «истинной» регенерацией, в процессе которой начинает развиваться новый организм, находящийся в стадии протонемы [22]. В нашем исследовании показано, что первое деление протопластов является уникальным модельным процессом для изучения клеточных механизмов поляротропизма и ориентировки плоскости деления.

Исследование навигации фрагмопласта проводится обычно в клетках в составе интактных тканей или органов высших растений. Нам неизвестны работы других авторов, в которых ориентация цитокинетического аппарата при воздействии внешних векторных факторов изучалась бы в протопластах высших растений с использованием методов иммунофлуоресценции. В нашей работе мы разработали уникальный подход, впервые позволивший изучать ориентированную реорганизацию цитоскелета в протопластах, иммобилизованных в агаризованной среде.

Проведённое нами сочетание трёх экспериментальных подходов – культуры про-топластов, иммунофлуоресценции и поляротропизма – в одном эксперименте позволило изучить реорганизацию элементов цитоскелета в процессе ориентированной регенерации протопластов мха P. patens и впервые продемонстрировать векторное воздействие плоско-поляризованного света на навигацию веретена деления и фрагмопласта высшего растения. Полученные результаты свидетельствуют о том, что первое деление протопластов мха является значительным этапом развития организма, во время которого происходит ориентация цитокинетического аппарата при участии дихроичных пигментных систем. Известно, что поляротропические реакции в клетках мхов [21] и папоротников [23] могут регулироваться фитохромом. Полученные нами результаты открывают перспективу для исследования новых функций дихроичных фоторецепторных систем, включая фитохром, которые связанны с ориентацией цитокинетического аппарата - процессом, играющим ведущую роль в формообразовании высших растений.

Физиология и биомеханика процесса выделения протопластов связаны с быстрой и существенной перестройкой клеточной архитектоники. Можно предположить, что при отделении протопласта от клеточной стенки генерируется каскад стрессовых сигнальных реакций, подобных тем, которые связаны с плазмолизом, вызванном засолением или засухой. Частично изменения белкового профиля протопластов могут быть связаны с самим процессом их выделения, который, по-видимому, носит стрессовый характер для клетки протонемы, выходящей из механически прочного полисахаридного «футляра» в гипертонический раствор. При протеомном анализе протопластов P. patens были выдвинуты предположения, что в момент выделения в интактных протопластах мха происходит как запуск синтеза новых «регенерационных» белков, необходимых для перепрограммирования клетки и инициации развития из нее нового организма, так и элими-нация белков, специфичных для клеток протонемы [16]. В процессе изучения пептидных пулов протонемы и протопластов мха установлено, что выделение протопластов мха сопровождается деградацией белков, среди которых большую долю составляют белки системы фотосинтеза; это приводит к генерации эндогенных пептидов, характерной для стрессовых процессов высших растений [17]. Таким образом, в процессе выделения протопластов, происходит изменение белкового и пептидного профилей, которые, возможно, играют роль в изменении физиологического статуса клетки и ее биофизических особенностей, связанных с реакциями на электромагнитные и гравитационные стимулы. В настоящем исследовании заложена основа векторных цитокинетических моделей для применения новейших биохимических подходов при изучении молекулярных основ морфогенеза.

Работа выполнена при поддержке гранта Швейцарского фонда научных исследований FNRS №7GUPJ04517.

Литература

1.    Muller S., Whight A.J., Smith L.G. Division plane in plants: new players in the band // Trends in Cell Biology. - 2009. - V. 19. - P. 180-188.
2.    Green P.B. Pattern formation in shoots: a likely role for minimal energy configurations in tu-nica // International Journal of Plant Sciences. - 1992. - V. 153. - P. 59-75.
3.    Green P.B. Connecting gene and hormone action to form, pattern and organogenesis: bio-physical transductions // Journal of Experimental Botany. - 1994. - V. 45 Special Issue. - P. 1775-1788.
4.    Раздорский В.Ф. Архитектоника растений. М.: Советская наука, 1955. - 524 c.
5.    Раздорский В.Ф. Анатомия растений. М.: Советская наука, 1949. - 536 c.
6.    Sinnott E.W., Bloch R. Division in vacuolate plant cells // American Journal of Botany. -1941. - V. 28. - P. 225-232.
7.    Скрипников А.Ю. Роль цитоскелета в морфогенезе высших растений. II. Цитокинетиче-ский аппарат. // Вестник МГАУ. - 2008. - Т. 1. - C. 115-118.
8.    Скрипников А.Ю. Роль цитоскелета в морфогенезе высших растений. I. Веретено деле-ния. // Вестник МГАУ. - 2007. - Т. 1. - C. 158-164.
9.    Скрипников А.Ю. Роль цитоскелета в морфогенезе высших растений. III. Кортикальный цитоскелет. // Вестник МГАУ. - 2008. - Т. 2. - C. 122-127.
10.    Скрипников А.Ю. Разработка клеточных морфогенетических модельных систем - ак-туальная биотехнологическая задача ботаники, биофизики и биологии развития // Вестник МГАУ. - 2006. - Т. 2. - C. 37-44.
11.    Lloyd C. Plant morphogenesis - life on a different plane // Current Biology. - 1995. - V. 5. -P. 1085-1087.
12.    Kern V.D., Schwuchow J.M., Reed D.W., Nadeau J.A., Lucas J., Skripnikov A., Sack F.D. Gravitropic moss cells default to spiral growth on the clinostat and in microgravity during spaceflight // Planta. - 2005. - V. 221. - P. 149-157.
13.    Schaefer D., Zryd J.-P. The moss Physcomitrella patens, now and then // Plant Physiology. -2001. - V. 127. - P. 1430-1438.
14.    Rensing S.A., Lang D., Zimmer A.D., Terry A., Salamov A., Shapiro H., et al. The Phy-scomitrella Genome Reveals Evolutionary Insights into the Conquest of Land by Plants // Science. -2008. - V. 319. - P. 64-69.
15.    Скрипников А.Ю. Мох Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. - фундаментальный и при-кладной объект протеомики и биологии растений // Вестник МГАУ. - 2007. - Т. 2. - C. 195-200.
16.    Скрипников А.Ю., Поляков Н.Б., Толчева Е.В., Великодворская В.В., Долгов С.В., Де-мина И.А., Рогова М.А., Говорун В.М. Протеомный анализ мха Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. // Биохимия. - 2009. - Т. 74. - C. 593-606.
17.    Скрипников А.Ю., Аниканов Н.А., Казаков В.С., Долгов С.В., Зиганшин Р.Х., Говорун В.М., Иванов В.Т. Поиск и идентификация пептидов мха Physcomitrella patens // Биоорганическая химия. - 2010. - В печати.
18.    Ashton N.W., Cove D.J. The isolation and preliminary characterisation of auxotrophic and analogue resistant mutants in the moss Physcomitrella patens // Mol Gen Genet. - 1977. - V. 154. - P. 87-95.
19.    Grimsley N.H., Ashton N.W., Cove D.J. The production of somatic hybrids by protoplast fu-sion in the moss Physcomitrella patens // Mol Gen Genet. - 1977. - V. 154. - P. 97-100.
20.    Reski R., Faust M., Wang X.-H., Wehe M., Abel W.O. Genome analysis of a moss, Phy-scomitrella patens (Hedw.) B.S.G. // Mol Gen Genet. - 1994. - V. 244. - P. 352-359.
21.    Mittmann F., Brucker G., Zeidler M., Repp A., Abts T., Hartmann E. Targeted knockout in Physcomitrella reveals direct actions of phytochrome in the cytoplasm // PNAS. - 2004. - V. 101. -P. 13939-13944.
22.    Hohe A., Reski R. From axenic spore germination to molecular farming. One century of bryophyte in vitro culture // Plant Cell Reports. - 2005. - V. 23. - P. 513-521.
23.    Wada M., Sugai M. Photobiology of ferns // Photomorphogenesis in plants - 2nd Edition / Eds. R. E. Kendrick, G. H. M. Kronenberg. - Dordrecht: Kluwer, 1994. - P. 783-802.

Источник - ВЕСТНИК МИЧГАУ, научно-производственный журнал, 2010, № 1,  Печатная версия.