Н.В. Соловых
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина, г. Мичуринск, Россия
Введение
Современные сорта сельскохозяйственных растений должны обладать не только высокой урожайностью и хорошими качествами плодов, но и достаточным потенциалом адаптации к неблагоприятным факторам внешней среды. Одним из наиболее вредоносных абиотических воздействий является избыточное засоление почв. Оно действует постоянно, существенно ухудшает физиологическое состояние растений и снижает их продуктивность (Удовенко, 1977). Ожидается, что к середине текущего столетия засолению будет подвергнуто более 50% территорий (Ashraf, 1994). Необходимость использования засолённых земель требует выведения солеустойчивых сортов сельскохозяйственных растений.
Одним из перспективных методов получения солеустойчивых генотипов является тканевая селекция. Она заключается в отборе в селективных условиях резистентных к заданному неблагоприятному воздействию тканей, из которых регенерируют растения. Преимуществом названного метода является возможность в строго контролируемых условиях и малых объёмах осуществлять отбор на большом количестве биологического материала. Устойчивость к засолению определяется на клеточном уровне (Dolgykh, 1994). Следовательно, растения-регенеранты, полученные из резистентных тканей, также должны проявлять солеустойчивость (Носов, 1999). Однако полученная в процессе тканевой селекции устойчивость в ряде случаев может оказаться эпигенетической. Кроме того, в силу гетерогенности каллусов, которую они частично сохраняют даже после длительного культивирования на селективных средах, начало растению-регенеранту может дать неустойчивая клетка. Поэтому необходима диагностика на резистентность к избыточному засолению растений, полученных в процессе тканевой селекции.
Наиболее надёжную оценку солеустойчивости можно получить путём выращивания растений на почвах с различной степенью засоления. Но такой способ характеризуется высокой трудоёмкостью и требует больших затрат времени. Более перспективными являются экспресс-методы диагностики, позволяющие в динамике исследовать действие дестабилизирующих факторов, например такие, как импульсно-модулированная хлорофиллфлуоресценция (Schreiber, Schliwa , Bilger, 1986) и лазерный анализ микроструктуры тканей – ЛАМ (Будаговский А.В., Будаговская О.Н., Ленц и др., 1998; Будаговская, 2004). Преимуществом этих методов является простота их использования и сравнительно небольшое время диагностики (48-72 часа). Однако они могут быть применены только к растениям in vivo. Поэтому все полученные в процессе тканевой селекции растения-регенеранты должны пройти клональное микроразмножение, укоренение in vitro и адаптацию к условиям in vivo. После тестирования на солеустойчивость часть из этих растений приходится отбраковывать, т.к. они не обладают желаемым признаком.
Необходим метод, позволяющий на ранних этапах тканевой селекции в условиях in vitro проводить одновременную оценку большого числа генотипов и отбраковывать неустойчивые формы. Было предложено предварительно оценивать устойчивость к хло-ридному засолению по интенсивности роста и размножения микропобегов на средах, содержащих NaCl (Соловых, 2004, 2007). Однако есть сведения о влиянии на солеустой-чивость растений особенностей работы их корневой системы (Удовенко, 1977). Это ставит под вопрос корректность методов диагностики, в которых используются листья, листовые высечки или побеги.
Данная работа проведена с целью определения соответствия солеустойчивости микропобегов in vitro солеустойчивости растений, произрастающих в грунте. Оценивалась эффективность применения биотехнологического метода диагностики данного признака в процессе тканевой селекции растений рода Rubus.
Материалы и методика исследований
В процессе исследований были использованы сорт малины красной Вольница, сорт ежевики Блэк сэтин, малина чёрная сорта Кумберленд, и малино-ежевичный гибрид Бойсенберри.
Изучение солеустойчивости генотипов in vitro проводили размножением микропобегов представителей рода Rubus на средах с различными концентрациями хлорида натрия. Ис-пользовали среду с минеральным составом по прописи MS (Murashige, Skoog, 1962), содержащую 30 г/л сахарозы, 1 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП), 0,1 мг/л ?-индолил-3-масляной кислоты (ИМК) и 1 мг/л гибберелловой кислоты (ГК). Концентрация хлорида натрия составила 17, 50, 100, 150 и 200 мМ. Контролем служила среда, не содержащая NaCl. Сосуды с микропобегами содержали при 23 - 25оС, освещённости 2000-2500 люкс и 16-часовом световом дне. Учитывали коэффициенты размножения микропобегов, их рост и степень некротизации листьев в условиях засоления.
Для оценки адекватности используемого биотехнологического метода диагностики солеустойчивости полученные с его применением данные проверяли методом выращивания растений на засолённых субстратах, методом листовой диагностики и методом лазерного анализа микроструктуры тканей (ЛАМ).
Для проведения листовой диагностики устойчивости к хлоридному засолению листья (4 – 5 лист от верхушки стебля) помещали в дистиллированную воду, содержащую 0 (контроль), 50, 100 и 200 мМ (0; 2,85; 5,7 и 11,4 г/л) NaCl. Через 24, 48, 72 и 96 часов проводили балльную оценку площади солевых некрозов на листьях (отсутствие некротизации -0 баллов, некротизация 10% площади листа – 1 балл; 25% - 2 балла; 50% - 3 балла; 75% -4 балла;100% - 5 баллов).
Для оценки солеустойчивости указанных генотипов на уровне целого организма растения выращивали в сосудах с почвенным субстратом. Поддерживали постоянную концентрацию хлорида натрия в почвенном растворе на уровне 200 мМ. Затем проводили учёт солевых некрозов на листьях.
При использовании метода ЛАМ листовые высечки изучаемых форм помещали в чашки Петри с водными растворами поваренной соли. Концентрации растворов составили 0, 100 и 200 мМ. Функциональное состояние растений определяли через 24, 48, 72 и 96 часов после помещения листьев в солевые растворы с помощью прибора ФСР-03-08 (Будаговская, 2004). Показатель функционального состояния определяли по способности хлорофилл-белкового комплекса к светоиндуцированным конформационным перестройкам. Он рассчитывался по формуле:
ПФС=(Imax – Imin):Imin,
где Imax –интенсивность рассеянного света на начальный момент измерений после корректировки нелинейности показаний прибора;
Imin –интенсивность рассеянного света в конце измерений;
ПФС – показатель функционального состояния листьев.
Математическая обработка экспериментальных данных проведена с помощью статистического пакета программы Microsoft excel.
Результаты исследований и обсуждение
В процессе культивирования микрочеренков на средах для размножения с различными концентрациями NaCl установлено, что наиболее удобным для оценки соле-устойчивости земляники и представителей рода Rubus является коэффициент размножения микропобегов в присутствии хлорида натрия (рис. 1). Наибольшее снижение коэффициента размножения микропобегов в условиях засоления наблюдалось у малины чёрной, наименьшее – у ежевики. Бойсенберри и малина красная сорта Вольница заняли промежуточное положение по данному показателю.
Рисунок 1 – Размножение представителей рода Rubus в присутствии хлорида натрия (42 дня). (см. печатную версию ВЕСТНИК МИЧГАУ)
Описанным способом можно проводить оценку сортов и видов на солеустойчи-вость. Указанный метод достаточно дорог и трудоёмок. Использование его требует длительного времени (45 - 60 суток). Однако в процессе тканевой селекции применение его целесообразно на этапе размножения растений-регенерантов, полученных из соле-устойчивых каллусов, для предварительной отбраковки неустойчивых форм.
Для проверки адекватности предложенного биотехнологического метода тестирования солеустойчивости была проведена оценка резистентности к NaCl изучаемых форм также методом листовой диагностики и методом культивирования растений на засолённом субстрате. Экспериментально определена оптимальная для тестирования солеустойчиво-сти концентрация хлорида натрия. В обоих случаях она составила 200 мМ. Результаты диагностики, полученные с использованием листьев, отличались от результатов, полученных с использованием растений, только сроками развития симптомов солевого поражения. При листовой диагностике уже через 48 часов на листьях появляются солевые некрозы, и можно регистрировать видимые различия в реакции генотипов на засоление. На 3-4 сутки после помещения черешков листьев в раствор соли различия выражены наиболее ярко. При тестировании солеустойчивости целых растений методом культивирования на засо-лённом субстрате различия между изучаемыми генотипами проявлялись наиболее ярко к концу первой недели культивирования. Из изученных форм наибольшую солеустойчи-вость по данным, полученным обоими методами, проявила ежевика Блэк сэтин, низкую – малина чёрная. Малина красная и Бойсенберри заняли промежуточное положение (рис. 2).
Недостатком обоих методов является то, что солевые некрозы не всегда образуются. Иногда листья засыхают, сохраняя цвет, как это бывает у чёрной малины. Это затрудняет сравнение генотипов и ставит под сомнение корректность методов.
Более чувствительным оказался метод ЛАМ. Оптимальная для диагностики концентрация хлорида натрия также равна 200 мМ. Различия между видами растений рода Rubus по степени изменения показателя функционального состояния (ПФС) под действием хлоридного засоления наблюдались уже через 48 часов и возрастали с увеличением продолжительности воздействия дестабилизирующего фактора. Наиболее чётко различия между изучаемыми генотипами проявляются через 72-96 часов. Полученные методом ЛАМ данные позволяют утверждать, что наибольшую устойчивость к хлоридному засолению демонстрирует ежевика, низкую – малина чёрная, среднюю - малина красная и Бойсенберри (рис. 3).
Таким образом, результаты биотехнологической оценки in vitro солеустойчивости представителей рода Rubus хорошо согласуются с данными, полученными методом ЛАМ, методом листовой диагностики и методом выращивания растений на засолённом субстрате. То есть солеустойчивость микропобегов in vitro даёт адекватное представление о со-леустойчивости растений in vivo.
Метод предварительной диагностики in vitro был применён при тканевой селекции на устойчивость к хлоридному засолению сорта малины красной Беглянка и малиноежевичного гибрида Бойсенберри. Из отобранных на селективных средах солеустойчи-вых каллусов названных генотипов была осуществлена индукция морфогенеза. Полученные из отобранных на солеустойчивость и контрольных (культивируемые ранее на средах без селективных агентов) каллусов адвентивные побеги размножали на питательной среде по прописи MS, содержащей 1 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ГК и 200 мМ хлорида натрия. Адвентивные побеги, полученные в процессе тканевой селекции, продемонстрировали в большинстве случаев более высокую солеустойчивость, чем контрольные. Это проявилось в более интенсивном росте и размножении их на средах с избыточным засолением. От 65% (Бойсенберри) до 77% (Беглянка) полученных из солеустойчивых каллусов побегов сохранили способность к росту и размножению в присутствии 200 мМ NaCl. У контрольных образцов Бойсенберри только 2 побега (4%) оказались способны к размножению на селективной среде, контрольные побеги малины сорта Беглянка на среде, содержащей 200 мМ хлорида натрия, полностью утратили способность к росту и размножению. Уже через 14 дней у них наблюдались признаки некротизации нижних листьев.
Проявившие резистентность к NaCl побеги прошли укоренение на среде MS, содержащей 0,5 мг/л ИМК и адаптацию in vivo в малогабаритной плёночной теплице с воздушно-капельным орошением. Была проведена листовая диагностика солеустойчивости полученных методом тканевой селекции растений. Они показали более высокую резистентность к хлоридному засолению, по сравнению с исходными сортами. Тестирование методом ЛАМ подтверждается повышенная устойчивость к хлориду натрия растений малины красной Беглянка и малино-ежевичного гибрида Бойсенберри, отобранных в процессе тканевой селекции.
Заключение
Результаты диагностики солеустойчивости методом культивирования микропобегов на искусственных питательных средах согласуются с результатами, полученными методами культивирования растений на засолённых субстратах, листовой диагностики и лазерного анализа микроструктуры тканей. Использовать биотехнологический метод диагностики целесообразно в процессе тканевой селекции на этапе размножения полученных из отселектированных тканей побегов. Применение оценки солеустойчивости in vitro, позволяет ускорить селекционный процесс за счет совмещения клонального микроразмножения растений-регенерантов in vitro с отбраковкой форм, не несущих желаемого признака.
Литература
1. Будаговский, А.В. Новый метод анализа функционального состояния культурных растений [Текст] / А.В. Будаговский, О.Н. Будаговская, Ф. Ленц, А. Мировская, К. Элькаут // Пути повышения устойчивости садоводства. - Мичуринск, 1998. -C. 98-113.
2. Будаговская, О.Н. Лазерная диагностика растений [Текст] / О.Н. Будаговская // Механизация и электрификация сельскохозяйственного производства. - 2004, № 9. - С. 24-26.
3. Носов A.M. Культура клеток высших растений - уникальная система, модель, инструмент. Обзор / А.М. Носов // Физиология растений.-1999. - Т .46, №6. - С.837-844.
4. Соловых, Н.В. Методы предварительного тестирования in vitro на устойчивость к стрессорам растений, полученных с применением тканевой селекции [Текст] / Н.В. Соловых // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии : III Междунар. науч. конф. 19 октября 2004 г : тез. докл . – М., 2004. – С. 77–79.
5. Соловых, Н.В. Тестирование in vitro земляники на солевыносливость [Текст]/ Н.В. Соловых // Перспективы селекции яблони и других культур для промышленных насаждений : материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвящённой 130-летию со дня рождения С.Ф. Черненко, 21-23 ноября 2007 года. – Мичуринск-наукоград РФ, 2007. – С. 148 -151.
6. Удовенко, Г.В. Солеустойчивость культурных растений [Текст]/. Г.В. Удовенко - Ленинград: Колос, 1977, - 215 с.
7. Ashraf M. Breeding for Salinity Tolerance in Plants [Text] / M. Ashraf // Crit. Rev. Plant Sci. 1994. – V. 13. Р. 52-57.
8. Dolgykh, Yu. I. Establishment of Callus Cultures and Regeneration of Maize Plants [Text] / Yu. I. Dolgykh // Biotechnology in Agriculture and Forestry/ Ed. Bajaj Y.P.S. Berlin: Springer, 1994. -V 25. -P. 24-36.
9. Schreiber U. Continuous recording of photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometr [Text]/ U. Schreiber, U. Schliwa, W. Bilger // Photosynth. Res. -1986. -№ 10, -Р. 15-21.
10. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures [Text] / T. Murashige, F. Skoog// Physiol. Plant. - 1962. - V.15, № 13, P. 473-497.
Источник - ВЕСТНИК МИЧГАУ, научно-производственный журнал, 2010, № 1, Печатная версия.